[신장내과] 만성 복막투석 동물모델에서 복막 섬유화에 대한 Pirfenidone의 억제 효과

 동국대학교 의과대학 내과학교실

이창화, 김응석, 이정호

 

서  론

 

말기 신부전 환자는 국내에서도 매년 10% 이상 증가하고 있으며, 이들 대부분은 유지 투석으로 혈액투석과 복막투석 중의 하나를 선택하게 된다. 최근 초기 신대체요법으로서의 복막투석은 혈액투석에 비해 많은 장점이 있다고 보고 되어 있으며 이로 인해 복막투석에 대한 관심이 더욱 증가하고 있는 실정이다.

 

하지만 복막투석으로 생체가 부적합한 투석액에 장기간 반복적으로 노출되는 경우, 투석막으로서의 복막이 형태적으로나 기능적으로 심각한 변화를 초래하게 된다. 투석에 의한 복막의 변화를 조직학적 측면에서 살펴보면 먼저 중피세포가 탈락하고 섬유아세포가 활성화되어 복막의 섬유화를 일으키게 된다. 또한 이러한 변화는 복막의 중피 뿐만 아니라 중피하 간질 조직에도 나타나게 되어 복막의 용질 수송에 영향을 미친다. 투석을 장기간 시행할 경우 저분자 용질에 대한 복막의 투과도가 증가하는 것을 볼 수 있는데 이는 투석액과 조직 사이의 포도당 삼투압 차이를 신속하게 줄여 삼투압차에 의한 초여과를 현저히 감소시킨다. 이러한 초여과 부전 (ultrafiltration failure)은 복막투석을 장기간 시행하는 환자에서 더 이상 복막투석을 지속할 수 없게 하는 중대한 원인 중 하나이다. 복막투석을 성공적으로 장기간 시행하기 위해서는 투석막으로서의 복막의 기능을 오랫동안 보존하는 것이 중요하며, 이를 위해 복막 섬유화를 감소시키거나 예방하는 것이 중요한 과제로 대두되었다.

 

복막 섬유화 예방을 위한 여러 선행 연구들 즉, 복막 휴식, 생체 적합한 투석액의 개발, 투석액 내의 당분해산물 농도 감소, 포도당 중합체 투석액, 세포내 유리기 제거 물질 및 항섬유화제제 등에 관한 연구가 보고 되고 있으나 아직 미흡한 실정이다. Pirfenidone (PFD)은 새로 개발된 항섬유화제제로 세포외 기질의 침착을 막거나 역전시켜 섬유화를 억제하는 것으로 알려져 있으며, 많은 연구자들이 여러 분야에서 시도하여 비교적 만족할 만한 결과를 보고하고 있으나 만성 복막투석을 응용하여 형태학적 변화와 기능적인 변화를 관찰한 실험은 아직 보고 되어 있지 않은 실정이다. 이에 연구자는 장기 복막투석의 동물 모델을 이용하여 지속적인 투석액의 노출에 대한 복막의 형태적 및 기능적인 변화를 관찰하고, PFD 투여가 복막의 섬유화 예방과 용질 수송에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

 

  

대 상 및 방 법

 

1. 실험동물

Sprague-Dawley 쥐 30마리를 무작위 추출로 다음과 같이 세 군으로 분류하였다. I 군 (n = 6)은 투석을 시행하지 않은 정상 대조군으로 정상 사료를 먹였고, Ⅱ 군 (n = 12)은 4.25% 포도당 투석액 (Perisis^Ⓡ , Boryung Inc., Seoul, Korea)으로 매일 투석 하면서 정상 사료를 먹였고, Ⅲ 군 (n = 12)은 4.25% 포도당 투석액으로 매일 투석 하면서 PFD이 섞인 사료 (350 ㎎/㎏/day)를 먹였다. 실험 기간 동안 복막염이나 도관 기능 부전 (Ⅲ 군에서 1마리)이 생긴 쥐는 실험 종료 전에 관찰 대상에서 제외하여 최종적으로 24마리의 실험동물을 대상으로 자료 분석하였다.

 

2. 도관 및 plug 제작

도관은 실리콘 카테터 (1/16''×1/8'', Cole-Palmer Instrument Company, IL, USA)를 일정한 크기로 자르고 구멍을 내어 Tenchkhoff 도관과 비슷하게 만든 후, 의류용 나이론제 접착천 (velcro)을 사용하여 이중 cuff를 만들어 부착하였다. 도관 입구를 막기 위해서 도관 내부 지름과 같은 16 gauge 주사 바늘 내부에 실리콘을 채워 끝을 잘라 마개를 만들었다.

 

3. 도관 삽입

실험동물을 Isoflurane (Forane^Ⓡ, Choongwae Inc., Seoul, Korea)으로 흡입 마취한 후, 복부의 털을 제거하고 소독액 (Amukin^Ⓡ, Amuchina, Italy)으로 주변부를 소독하였다. 검상돌기 1 ㎝ 하방에서 정중선을 따라 3 ㎝ 정도 절개한 후 절개를 복강이 나올 때까지 실시하여 복강 내로 구멍을 만들어 도관을 삽입하였다. 내측 cuff를 복근 위쪽에 봉합하여 고정시킨 후 반대편 끝은 투관침 (trocar, 직경 3 ㎜)을 연결하여 실험동물의 견갑골 사이에 출구가 생기도록 피하 터널을 만들었다. 외측 cuff는 출구 하방에 위치하도록 하였으며 외부로 나온 도관은 2 ㎝를 남기고 자른 후 그 끝은 마개로 막았다. 모든 시술은 출혈이나 복막 손상을 피하기 위하여 주의 깊게 시행하였다. 시술이 끝난 실험동물은 마취가 완전히 깬 후 다시 사육장에 넣었다. 도관 삽입 후 첫 5일간 감염 방지를 위해 예방적 목적의 항생제 (Vancomycin 120 ㎎/L, Gentamicin 32 ㎎/L)를 투석액에 넣어 사용하였다.

 

4. 복막염 검사

복막염 진단을 위해 주 1회, 아침 투석전에 투석 배액을 채취하여 배양 검사를 실시하였고, 10개 이상의 균집락이 있는 경우를 복막염으로 간주하였다. 실험 기간 동안 복막염이 생긴 쥐는 관찰 대상에서 제외하였다.

 

5. 투석액 교환

사육장에서 실험동물을 꺼내 도관의 끝을 3% Amukin^Ⓡ으로 소독하고 도관 마개를 제거한 후 복강 내에 남아 있는 투석액을 외부로 배출 시킨 다음 투석액 25 ㎖를 도관을 통해 서서히 주입하였다. 투석액 주입 후 멸균 처리된 금속 마개로 도관을 밀봉한 후 다시 사육장에 넣었다.

 

투석액 교환은 도관 삽입 후 첫 날부터 실시하였고 첫 3일 동안 서서히 투석액 주입량을 증량하여 3일째에 1회 주입량이 25 ㎖가 되도록 하였다. 투석액에는 감염 방지를 위해 예방 목적의 항생제 (Gentamicin 8 mg/L, Vancomycin 25 mg/L, Ciprofloxacine 25 mg/L, Ceftazidime 125 mg/L 순으로 5일간)를 사용하였다. 투석액의 교환은 오전 8시, 오후 2시, 저녁 10시 하루 세 번 12주 동안 시행하였다.

 

6. 체중 측정

모든 실험동물은 실험 시작시, 2주, 4주, 8주, 그리고 12주에 투석액 주입 전에 체중을 측정하였다.

 

7. 복막 평형 검사 (Peritoneal Equilibration Test, PET)

복막의 기능은 1.5% 포도당 투석액을 이용한 1시간 PET을 사용하여 검사하였으며, 투석액은 도관을 통해 채취하였고, 혈액은 심장 천자로 3 ㎖ 채취한 후 각각의 검체에서 urea nitrogen, creatinine, 포도당을 측정하였다. 복막의 용질 수송능 비교를 위해 urea nitrogen의 투석액 대 혈장 농도비 (D/P urea nitrogen)와 1시간 투석 후와 투석 전의 투석액 내 포도당 농도비 (D/D₀ glucose)를 측정하였다.

 

8. 형태 계측학적 분석

복막은 먼저 육안적으로 섬유화의 유무를 관찰한 후 복벽 (우상복부)과 간을 채취하였다. 표본은 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후 일반적인 방법에 준하여 파라핀에 포매하고 4 ㎛로 조직 절편을 만든 후 H & E 염색을 시행하였으며 복막 섬유화의 형태 계측학적 측정을 위해 Masson's trichrome 염색을 하였다. 중피세포와 중피하 간질 조직을 포함하는 복막의 두께는 무작위로 10군데를 측정하여 그 평균값으로 하였고 Image-Pro Plus 4.0 (Media Cybernetics Inc., MD, USA)을 이용하여 계측하였다.

 

9. 통계적 검정

모든 수치는 평균값 ± 표준오차로 표시하였으며 시간 변화에 따른 수치의 변화는 one way ANOVA로 그 차이를 검증하였고 p값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다. 모든 통계적 분석은 Sigma-Stat 2.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다.

 

 

결  과

 

1. 체중 변화

실험 기간 중 체중 변화는 <Table 1>에 요약되어 있는 바와 같다. 실험 시작시 평균 체중은 약 254 gm이었으며 세 군 사이의 체중에는 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. 시간이 경과함에 따라 모든 군에서 체중이 증가하였다. 대조군 (I 군)은 투석군 (Ⅱ 및 Ⅲ군)에 비해 현저한 체중 증가를 보였다 (각각 4주에 p > 0.05 및 p < 0.05, 8주에 p < 0.05 및 p < 0.05, 12주에 p < 0.05 및 p < 0.05). 투석군 간의 비교에서는 PFD 치료군에서 전반적으로 체중의 증가가 둔화되는 경향을 보였으며 8주에는 유의한 차이가 있었다 (p = 0.018).

 

Table 1. Changes in body weight (gm)

	Baseline	2 weeks	4 weeks	8 weeks	12 weeks
Group I (n = 6)	255.1±9.3	354.1±16.5	439.6±29.6	496.7±39.5	548.7±47.1
Group Ⅱ (n = 10)	255.0±13.1	344.5±16.1	418.1±29.3	446.4±28.7*	458.2±20.3*
Group Ⅲ (n = 8)	254.5±8.6	331.5±14.5	392.5±27.2*	405.0±37.5*†	439.5±29.5*

^*p<0.05, compared to group I, ^†p= 0.018, compared to group Ⅱ

 

2. 복막염 빈도

각 군에서 복막염의 빈도는 Ⅱ 군은 2마리, Ⅲ 군은 3마리가 발생하여 즉시 희생시켰으며 자료 분석에서 제외하였다.

 

3. 복막 평형 검사

실험 기간 중 D/Do glucose의 변화는 <Table 2>와 같다. 기저치 0.41로 시작하여 시간이 경과함에 따라 투석군에서 감소하였다. 투석군 (Ⅱ 및 Ⅲ군)은 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며 (각각 p < 0.001 및 p < 0.001), 투석군 간의 비교에서는 PFD 치료로 복막의 과투과도가 현저하게 호전되었다 (p < 0.05).

실험 기간 중 D/P urea nitrogen의 변화는 Table 3과 같다. 기저치 0.72로 시작하여 시간이 경과함에 따라 증가하는 과투과도 현상을 나타냈다. 투석군 (Ⅱ 및 Ⅲ군)은 대조군에 비해 유의하게 증가되었으며 (각각 p < 0.001 및 p < 0.001), 투석군 간의 비교에서 PFD 치료군에서 복막의 과투과도가 유의하게 향상되었다 (p < 0.05).

 

Table 2. Changes in D/D₀ glucose

	Baseline	Final
Group I (n=6)	0.40 ± 0.03	0.39 ± 0.02
Group Ⅱ (n=10)	0.41 ± 0.06	0.31 ± 0.06*
Group Ⅲ (n=8)	0.41 ± 0.04	0.37 ± 0.04*†

^*p<0.001, compared to group I, ^†p<0.05, compared to group Ⅱ

 

Table 3. Changes in D/P urea nitrogen

	Baseline	Final
Group I	0.72 ± 0.06	0.75 ± 0.05
Group Ⅱ	0.72 ± 0.07	0.94 ± 0.04*
Group Ⅲ	0.73 ± 0.09	0.83 ± 0.08*†

^*p<0.001, compared to group I, ^†p<0.05, compared to group Ⅱ

 

4. 형태 계측학적 분석

전반적으로 대조군에 비해 투석군에서 복막의 결체조직이 유의하게 증가되었고 특히 중피하 간질 조직이 비후되었다 (Table 4). 간을 둘러싸고 있는 장측 복막은 대조군에 비해 투석군 (Ⅱ 및 Ⅲ군)에서 유의하게 비후되었으며 (각각 p < 0.05 및 p < 0.05, Figure 1), 복벽의 벽측 복막 역시 대조군에 비해 투석군에서 현저하게 비후되었다 (각각 p < 0.001 및 p < 0.001). 투석군 간의 비교에서는 PFD 치료군에서 벽측 복막의 평균 두께가 유의하게 감소하였다 (p < 0.05, Figure 1).

 

Table 4. Mean thickness of the peritoneum (㎛)

	Liver	Abdominal wall
Group I	3.1 ± 0.9	13.7 ± 3.3
Group Ⅱ	10.9 ± 5.2*	59.5 ± 26.2†
Group Ⅲ	6.1 ± 1.7*	36.5 ± 11.2†‡

^*p<0.05, compared to group I, ^†p<0.001, compared to group I,

^‡p<0.05, compared to group Ⅱ

 

고  찰

 

합성된 반투막을 경계로 환자의 혈액이 투석액과 접하게 되는 혈액 투석과는 달리 복막 투석은 투석액이 직접 복막에 접촉하게 된다. 이때 복막의 중피세포는 단순히 생물학적 투과 장벽으로서의 역할 뿐 아니라 다양한 대사기능을 지닌다. 따라서 복막투석의 효율성은 투석막으로써 복막의 장기적인 보존 여부에 의해 결정되나 현재 보편적으로 사용되고 있는 저산도 (pH 5.2-5.5), 고삼투압 농도 (364-485 mOsm/L) 및 고포도당 (1.36-3.86 g/㎗)의 투석액은 복막의 형태와 기능에 여러 변화를 초래한다.

 

특히 복막염 발생시에는 복강 내에서 분비되는 여러 염증성 매개물과 cytokine에 의해 중피세포의 탈락, 중피세포 재생 (remesothelialization) 기전의 손상, 섬유아세포의 활성화로 인하여 복막 섬유화가 초래된다. 이는 복막 투과성의 증가와 초여과 부전 등의 기능적 변화를 초래하여 결국 복막투석을 중단하게 한다.

 

복막 손상의 최종 경로인 복막 섬유화를 막기 위한 여러 방법들이 시도되었다. 복막 휴식 (peritoneal resting)은 초여과를 호전시키고 복막 섬유화를 감소시킬 수 있는 한 가지 방법으로 알려져 있으나 초여과 부전의 종류, 휴식 기간과 휴식 기간 중의 혈액투석으로의 전환 등에 대해 논란이 있는 상태이다. 약물 요법으로는 복막의 산화적 손상을 막기 위하여 항산화제나 그 전구물질 또는 섬유화 억제제를 복막 투석액에 첨가하고자 하는 시도들이 있고, 산소 유리기(oxygen free radical)와 투석액 내의 cytokine 농도를 감소시키기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있다^.

 

섬유화 억제제에 관한 선행 연구로는 섬유아세포의 증식과 성장을 억제시키고 섬유화 촉진 cytokine인 TGF-β₁의 발현을 하향 조절하는 colchicine 안지오텐신 전환 효소 저해제와 전교원질의 당화, 수산화과정과 교차결합을 막아서 교원질 합성을 방해하는 D- penicillamine, 그리고 교원질 분해 효소의 생성을 증가시키는 인터페론²²⁾등이 알려져 있다. 그 밖에도 niacin이 산소 유리기를 없애고 taurine은 HOCl을 제거하여 세포막을 안정화시키는 효과가 있다는 보고도 있다.

 

PFD (5-methyl-1-phenyl-2-[1H]-pyridone)은 수용성의 흰색 결정이며 특발성 폐섬유화증, 다발성 경화증, 신장, 경화성 복막염, 자궁근종 등에서 새로운 섬유화 억제제로 알려져 있다. PFD의 작용 기전에 대해선 완전히 알려져 있지 않은 상태이나 섬유아세포의 성장과 증식을 막고 TGF-β₁과 TNF-α의 생성, 분비와 수용체를 방해하여 섬유화를 억제하고, 세포내 신호 전달 물질로 작용하여 복막 중피세포에 의한 세포외 기질 물질의 합성을 자극하여 복막 섬유화를 초래하는 산소 유리기를 용량 의존적으로 억제하며 기저막의 주성분인 4형 교원질을 분해하는 matrix metalloproteinase-9의 분비를 감소시켜 세포간질의 파괴를 억제하는 것으로 알려져 있다.

 

Suga 등³¹⁾은 0.1% chlorohexidine gluconate와 15% 에탄올의 복강 내 투여로 만든 경화성 복막염 동물 모델을 이용한 실험에서 PFD 투여는 간질 조직의 섬유화와 교원질 침착의 감소, 섬유아세포의 증식을 억제 시킴으로서 복막섬유화에 대한 억제효과가 있다고 보고하였다. 그러나 chlorohexidine gluconate와 에탄올의 복강 내 투여로 단기간에 경화성 복막염을 유발하여 장막의 두께만을 측정하고 기능적 변화를 고려하지는 않았다. 본 실험에서는 만성 복막투석에서의 실제 복막 투석 과정의 복막 섬유화 기전과 유사한 상태를 만들기 위해 4.25% 복막 투석액 (Perisis^Ⓡ)을 이용하여 12주간 하루 3회씩 복막 투석액 교환을 실시하여 복막 섬유화를 유도하였고 복막 평형 검사를 통해서 비후된 복막을 통한 과투과도 현상을 대조군과 비교하였다.

 

체중은 실험 과정에 있어 여러 환경요인에 의해 영향을 받기 때문에 실험동물의 전반적인 상태를 나타내는 중요한 지표로 알려져 있다. 본 연구에서 실험동물의 체중은 시간이 경과함에 따라 증가하였으며 이는 적합한 환경에서 사육이 되었음을 반영한다. 실험 기간 중 체중은 세 군 모두에서 증가하였으나 대조군에 비해 투석군은 체중의 증가가 둔화되었으며 투석군 간의 비교에서는 PFD을 투여한 군에서 투여하지 않은 군에 비해 낮은 체중 증가율을 보였다. 이러한 소견은 복막투석 자체가 스트레스로 작용하고 복막 투석 과정 중의 조작, 감염 방지를 위한 복강 내 항생제 투여, 투석액으로 인한 복부 팽만 등이 쥐의 식이에 변화를 주었을 것으로 사료되며, PFD 투여군에서 체중 증가가 둔화되었던 원인으로는 PFD이 섞인 사료를 모든 쥐들이 남김없이 먹는 양인 20 gm으로 하루 식이 양을 제한했기 때문으로 생각된다.

 

실험 과정 중에 발생한 복막염의 빈도는 투석을 시행한 두 군 간에 유의한 차이는 없었고 복막염 자체가 복막 섬유화와 비후를 초래하므로 복막염의 발생시에 즉시 실험동물을 희생하였고 관찰 대상에서 제외하였다.

 

복막 섬유화의 측정 방법으로는 복강 내의 육안적 관찰과 복강 유착의 점수를 매기는 방법 등이 있고, Frazier-Jessen 등은 활석(talc)으로 유도된 복막의 교원질 침착을 Masson's trichrome 염색을 이용하여 두께를 측정해서 정량화하는 방법을 소개하였다. 본 실험에서도 Frazier-Jessen의 방법을 이용하여 측정하였다. 복막 투석은 복벽을 둘러싸고 있는 벽측 복막의 교원질을 증가시켜 복막 섬유화를 초래하였으나 PFD의 투여는 복막의 비후를 유의하게 억제하였다. 간을 둘러싸고 있는 장측 복막에서도 두께가 감소되는 경향은 있었으나 통계적으로 유의하지 않았다. 이는 벽측 복막과 달리 장측 복막은 두께가 얇아서 두께 측정이 기술적으로 용이하지 않았다.

 

복막 투과도는 1.5% 포도당 투석액을 이용한 1시간 복막 평형 검사를 이용하여 glucose와 urea nitrogen을 이용한 복막 평형 검사에서 glucose의 흡수율 (D/D₀ glucose)과 urea nitrogen의 청소율 (D/P urea nitrogen)을 측정하여 알아보았다. D/P urea nitrogen이 높고, D/D₀ glucose가 낮을수록 과투과도가 있는 것으로 판단하였고 투석군에서 대조군에 비해 과투과도 현상이 관찰되었으며 PFD의 투여로 과투과도를 억제시키는 결과를 얻었다.

 

 결론적으로 항섬유화 제제인 PFD은 복막투석 동물모델에서 고농도 포도당 투석액으로 유발된 복막의 섬유화를 효과적으로 예방, 억제하고 복막의 과투과도를 향상시키는 효과가 있었다. 하지만 복막투석 환자에서의 임상적인 적용을 위해서는 향후 장기간의 동물실험 및 임상적 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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