[정신과] 만성 복막투석 동물모델에서 복막 내 제1형 수분통로 발현 및 수분이동의 변화

 

만성 복막투석 동물모델에서 복막 내 제1형 수분통로 발현 및 수분이동의 변화

 

동국대학교 의과대학 내과학교실, 병리학교실^*,

경북대학교 의과대학 생화학교실^†, 선내과의원^‡

 

이원재, 이준엽, 탁우택, 김기권^*, 권태환^†, 김응석^‡, 이정호

 

서  론

 

초기 신대체 요법으로서의 복막투석은 혈액투석에 비해 많은 장점이 있다고 알려져 있으나¹⁾, 복막투석은 생체 부적합한 투석액에 장기간 노출되는 경우, 투석막으로서의 복막이 형태학적으로나 기능적으로 심각한 변화를 일으켜^2-3) 한외여과 부전을 초래하며, 이는 장기간 복막투석을 시행하는 환자에서 더 이상 투석을 지속할 수 없게 하는 중대한 원인이 된다^4-7).

 

수분통로(aquaporin, AQP)는 수분을 선택적으로 통과시키는 세포막 단백이다. 1988년 Denker 등⁸⁾에 의해 사람의 적혈구에서 AQP-1이 최초로 발견된 이후, 여러 장기에서 여러 아형들이 추가로 발견되었으며, 이는 세포를 통한 수분 이동에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 복막의 경우 AQP-1, AQP-3, AQP-4가 복막의 중피세포⁹⁾와 모세혈관벽¹⁰⁾에 분포한다고 알려져 있으며, 이 중 AQP-1이 주된 아형으로 알려져 있다. 복강 내 수분이 이동하는 중요한 경계로는 복막 내 모세혈관벽, 결합조직, 그리고 내벽을 덮는 중피세포층 등이 있으며, 이 중 모세혈관벽이 가장 중요한 역할을 한다¹¹⁾.

 

이들 모세혈관 벽에는 3가지 서로 다른 pore가 존재(three pore model)하며^12-13) 단백질과 같은 대분자물질이 통과하는 large pore, glucose, creatinine, urea와 같은 소분자물질이 통과하는 small pore, 그리고 물분자만이 통과하는 ultrasmall pore 등이 있다. 전체 pore 중 small pore가 전체의 95%에 달하고 ultrasmall pore가 3-4%, large pore가 1-2%를 차지하고 있다¹⁴⁾. 그러나 포도당과 같은 결정질(crystalloid)을 삼투물질로 사용하는 경우, 복막을 통하여 이동하는 수분 총액의 50%가 ultrasmall pore를 통하여 이동하는 것으로 알려져 있다¹⁵⁾. AQP-1은 ultrasmall pore에 해당하며, 이는 복막투석 시 수분의 이동 및 제거에 매우 중요한 역할을 할 것으로 생각된다⁹⁾.  

 

따라서 복막 내 존재하는 수분통로의 발현 변화와 이에 따른 기능장애 정도가 장기 복막투석 환자에서 발생하는 한외여과부전에 관여할 것으로 추정^16-17)되나, 기존의 연구에 의하면 고농도 포도당에 노출된 복막에서 수분통로 발현이 보고자에 따라 차이^18-20)를 보이고 있어, 복막투석에서 복막 내 수분통로의 발현정도에 따른 기능변화에 대한 이해가 아직 확실하게 정립되어 있지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 만성 복막투석 동물모델을 이용하여 포도당 투석액에 의한 복막 내 제 1형 수분통로의 발현 변화 및 이에 따른 수분이동의 변화를 알아보고자 하였다.

 

 

대상 및 방법

 

1. 실험동물

Sprague-Dawley 수컷 쥐 18 마리를 무작위로 추출하여 다음 두 군으로 분류하였다. 대조군(n=6)은 투석을 시행하지 않은 군이며, 투석군(n=12)은 4.25% 포도당 투석액(Peresis^Ⓡ, 보령제약, 한국)으로 매일 투석을 시행하였다. 실험 기간 중에 복막염이나 도관 기능부전이 생긴 쥐(투석군에서 4마리)는 실험 종료 전에 관찰대상에서 제외하였다.

 

2. 도관 및 도관마개 제작

도관은 실리콘 카테터 (1/16ˊˊ×1/8ˊˊ, Cole-Palmer Instrument Company, IL, USA)를 일정한 크기로 자르고 구멍을 내어 Tenchkhoff 도관과 비슷하게 만든 후, 의류용 나일론제 접착천(velcro)을 사용하여 이중 cuff를 만들어 부착하였다. 도관 입구를 막기 위해 도관 내부 지름과 같은 16 guage 주사 바늘 내부에 실리콘을 채워 끝을 잘라 도관마개를 만들었다.

 

3. 도관 삽입

실험동물을 Isoflurane (Forane^Ⓡ, 중외제약, 한국)으로 흡입 마취한 후, 복부의 털을 제거하고 소독액(Amukin^Ⓡ, Amuchina, Italy)으로 주변 부위까지 소독하였다. 검상돌기 1 cm 하방에서 정중선을 따라 3 cm 정도 절개한 후 절개를 복강이 나올 때까지 실시하여 복강 내로 구멍을 만들어 도관을 삽입하였다. 내측 cuff를 복근 외측에 봉합하여 고정시킨 후 반대편 끝은 투관침(trocar, 직경 3 mm)을 연결하여 실험동물의 견갑골 사이에 출구가 생기도록 피하 터널을 만들었다. 외측 cuff는 출구 하방에 위치하도록 하였으며 외부로 나온 도관은 2 cm를 남기고 자른 후 그 끝은 마개로 막았다. 모든 시술은 출혈이나 복막 손상을 피하기 위하여 주의 깊게 시행하였다. 시술이 끝난 실험동물은 마취가 완전히 깬 후 다시 사육장에 넣었다. 도관 삽입 후 첫 5일간 감염 방지를 위해 예방적 목적의 항생제 (Vancomycin 120 mg/L, Gentamycin 32 mg/L)를 투석액에 넣어 사용하였다.

 

4. 투석액 교환

사육장에서 실험동물을 꺼내 도관의 끝을 3% Amukin 으로 소독하고 도관마개를 제거한 후 복강 내에 남아있는 투석액을 외부로 배출시킨 다음 투석액 25 ㎖를 도관을 통해 서서히 주입하였다. 투석액 주입 후 멸균 처리된 금속마개로 도관을 밀봉한 후 다시 사육장에 넣었다. 투석액 교환은 도관 삽입 첫날부터 실시하되 투석액 사용량을 15 ㎖에서 서서히 증량하여 3일째부터 1회 주입량이 25㎖가 되도록 하였다. 이후 투석액 교환은 하루 3회(8:00 A.M., 2:00 P.M., 8:00 P.M.) 12주간 실시하였다. 투석액에는 감염 방지를 위해 매 5일마다 Gentamycin (8 mg/L), Ciprofloxacin (25 mg/L), Ceftazidime (125 mg/L), Vancomycin (25 mg/L) 순으로 항생제를 넣어서 사용하였다.

 

5. 복막염 검사

복막염 진단을 위해 주 1회, 아침 투석전에 투석배액을 채취하여 배양검사를 실시하였고, 10개 이상의 균집락이 있는 경우를 복막염으로 간주하였다.

 

6. 체중 측정

모든 실험동물은 실험 시작 1주, 3주, 6주, 9주 그리고 12주에 체중을 측정하였다. 체중 측정은 아침투석 직전에 시행하였다.

 

7. 복막 평형 검사 (Peritoneal Equilibration Test, PET)

복막의 기능 평가를 위해 1시간 PET을 1.5% 포도당 투석액을 사용하여 1주, 6주, 12주에 시행하였다. 투석배액은 도관을 통해 채취하고 혈액은 심장천자로 3 ㎖ 정도 채취한 후 각각의 검체에서 sodium, urea nitrogen, creatinine 및 포도당을 측정하였다. 복막의 용질수송능 비교를 위해 urea nitrogen 및 sodium의 투석액 대 혈장 농도비(D/P urea nitrogen, sodium)와 1시간 투석 후와 투석 전의 투석액 내 포도당 농도비(D/Do glucose)를 측정하였다.

 

8. 면역조직화학적 분석

12주 후 희생시킨 실험동물의 우상부 복벽, 간, 장간막 및 횡경막 등을 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하였다. 면역 염색을 위해 4 ㎛두께로 잘라 조직절편을 만든 후 H&E 염색을 시행하였고, 또한 AQP-1 및 후기당화산물(advanced glycosylation end product: AGE)에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. 과정을 간략하게 설명하면 조직 절편은 3% 과산화수소에 15분간 처리한 후에 Phosphate-buffered saline(PBS)으로 10분간 수세하고, 차단혈청에 1시간 작용시켜 비특이성 단백을 차단하였다.

 

절편을 PBS로 세척한 후 AQP-1 염색은 일차항체로 anti-AQP-1 mouse 다클론 항체 (CHEMICON International, Temecula, Califonia, USA)²¹⁾를 1:1000으로 희석하여 이용하였고, AGE 염색은 anti-AGE mouse 단일클론 항체(Dojindo laboratories, Japan)를 1:100으로 희석하여 이용하였는데, 각기 4℃ 습윤 상자에서 밤새 반응시켰다. 다시 PBS로 3차례 수세한 후 Biotin과 결합된 이차항체로 실온에서 반응시키고 PBS로 수세한 후 DAKO LSAB Kit (DAKO, USA)로 반응시켰다. Diaminobenzidine (Sigma, St. Louis, USA)으로 발색한 다음 흐르는 물에 수세하고, Mayer hematoxylin으로 대조염색을 한 후 봉입하였다. 대조염색은 1차 항체대신 PBS를 사용하여 동일한 방법으로 시행하였다. 염색된 조직 슬라이드는 5명의 판독자가 무작위로 선택된 순서에 의하여 염색의 강도를 비교 판독하였다. 염색강도의 점수는 반정량적 방법으로 음성인 경우는 0점, 약하게 염색된 경우는 1점, 중등도로 염색된 경우는 2점, 그리고 강하게 염색된 경우는 3점으로 하였다.

 

9. 통계적 검정

시간변화에 따른 각 군의 수치 변화는 unpaired t-test를 이용하여 그 차이를 검증하였다. 모든 수치는 평균값과 표준 오차로 표시하였으며, p <0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다. 모든 통계적 분석은 Sigma-Stat 2.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다.

 

 

결 과

 

1. 복막 내 제 1형 수분통로 발현

투석군은 대조군에 비해 복막 내 중피세포 및 혈관벽에서 AQP-1의 발현이 현저하게 증가되어 있었다(Figure 1). AQP-1의 염색정도를 반정량적으로 점수화하여 비교 분석한 결과 투석군(2.34±0.55)은 대조군(1.02±0.06)에 비해 유의하게 증가하였다(p <0.05)(Figure 2).

Figure 2

 

2. 복막 내 후기당화산물 발현

투석군은 대조군에 비해 복막 내 중피세포 및 혈관벽에서 AGE 발현이 현저하게 증가되었다(Figure 3). AGE의 염색 정도를 반정량적으로 점수화하여 비교 분석한 결과 투석군(1.63±0.77)은 대조군(0.02±0.04)에 비해 유의하게 증가하였다(p <0.05)(Figure 4).

Control

 PD

 

Figure 3

 

Figure 4

 

3. 수분의 이동

12주에 시행한 수분이동의 간접적인 지표인 D/P sodium은 투석군(0.58±0.04)이 대조군(0.86±0.07)에 비해 유의하게 낮았다(p <0.05)(Figure 5).     

Figure 5

 

4. 복막 평형 검사

D/D0 glucose는 시간이 경과함에 따라 전반적으로 감소하는 경향을 보였으며, 투석군은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(p <0.05). 시간 경과에 따른 D/D0 glucose의 변화는 1주 (기저치)에서 대조군(0.40±0.03)과 투석군(0.41±0.02)간의 차이가 없었으며, 6주에서도 대조군(0.39±0.03)과 투석군(0.32±0.04)사이에 의미 있는 차이를 관찰할 수 없었다. 그러나 12주에서 투석군(0.27±0.04)은 대조군(0.39±0.02)에 비해 현저하게 감소하였다(p <0.05)(table 1).

 

Table 1. Changes in D/Do glucose and D/P urea nitrogen with the time

Duration (weeks)	D/D0 glucose	D/P urea nitrogen
	Control         PD	Control        PD
1	0.4±0.03    0.41±0.02	0.82±0.06    0.82±0.11
6	0.39±0.03   0.32±0.04	0.83±0.08    0.90±0.06
12	0.39±0.02   0.27±0.04*	0.85±0.05   0.98±0.05*

^*p < 0.05, Control vs PD

 

D/P urea nitrogen은 시간이 경과함에 따라 전반적으로 증가하는 양상을 보였으며, 투석군은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 시간경과에 따른 D/P urea nitrogen의 변화는 1주 (기저치)에서 대조군(0.82±0.06)과 투석군(0.82±0.11)간의 차이는 없었으며, 6주에서도 대조군(0.83±0.03)과 투석군(0.90±0.06)사이에 의미 있는 차이는 없었다. 그러나 12주에서 투석군(0.98±0.05)은 대조군(0.85±0.05)에 비해 현저하게 증가하였다(p <0.05)(Table 1).

 

5. 체중 변화

시간이 경과함에 따른 체중의 변화는 Table 2에 요약되어 있는 바와 같다. 실험 시작하기 전 실험동물의 평균체중은 투석군(302.5±9.4 g)과 대조군(302±6.1 g) 사이에 의미 있는 차이는 없었다. 시간이 경과함에 따라 투석군(3주 440.1±29.7 g, 6주 481.4±23.7 g, 9주 518.6±24.7 g, 12주 568.2±28.1 g)은 대조군(3주 489.6±32.5 g, 6주 546.7±47.1 g, 9주 589.0±46.0 g, 12주 629.49 g)에 비해 체중이 유의하게 감소하였다(p <0.05). 전반적으로 시간이 경과함에 따라 현저한 체중 증가를 보였으나, 투석군은 대조군에 비해 체중증가가 적은 것으로 나타났다.

 

 

고  찰

 

본 연구에서 만성 복막투석 동물모델을 이용하여 장기간 투석을 시행하였던 실험의 결과는 다음과 같았다: 1) 복막 내 중피세포 및 혈관벽에서 AQP-1 발현은 고농도 포도당이 함유된 투석액으로 투석한 군에서 증가되어 포도당이 수분통로 발현에 기여함을 알 수 있었다. 2) 투석액 대 혈장 sodium 농도비는 투석군에서 낮게 나타나 수분통로 발현의 증가가 수분이동에 기여한 것으로 나타났다. 3) 복막 내 후기당화산물 발현은 고농도 포도당이 함유된 투석액으로 투석한 군에서 증가되었다. 4) 복막투과도는 투석군에서 높게 나타나 후기당화산물의 복막 내 발현이 과투과도에 일부 관여함을 알 수 있었다.

 

수분통로는 물만 선택적으로 통과시키는 세포막 단백들로 세포를 통한 수분의 이동에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 지금까지 인체에는 10종의 AQP 발현이 확인되었으며²²⁾, 인간의 복막의 경우에는 AQP-1, AQP-3, AQP-4의 발현이 보고 되었다²³⁾. 이 중 복막에서 AQP-1이 한외여과에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, AQP-3, AQP-7, AQP-9는 물뿐만 아니라 Urea와 Glycerol도 통과시켜 이들을 'aquaglyceroporins' 이라 부르기도 한다^24-26).

 

이에 부합하여 Yang 등²⁷⁾은 AQP-1유전자 결손 생쥐(AQP-1 gene knockout mice)실험에서 투석액과 혈액사이의 삼투압차에 의해 유발되는 수분이동의 40%가 감소되었다고 보고하였고, Carlsson 등⁹⁾은 복막투석 동물모델에서 수분통로 억제제인 염화수은(HgCl₂)을 복강 내 사용하면 한외여과가 감소한다고 발표하여 수분통로가 복막투석에서 수분의 이동에 중요하게 기여함을 알 수 있다.

 

그러나 박 등¹⁹⁾은 복막이 장기간 고농도의 포도당이 함유된 투석액에 노출되면 복막 내 AQP-1의 발현은 감소하고 복강을 통한 수분의 흡수는 증가한다고 보고했으나, Lai 등¹⁸⁾은 대조적으로 in vitro 실험에서 인체의 복막중피세포가 고농도의 포도당에 노출되는 경우 AQP-1과 AQP-3의 발현이 증가한다고 보고하여 장기간 복막투석을 하였을 때 복막 내 수분통로의 발현 변화와 한외여과부전과의 관계는 아직도 의견이 분분하며 불명확하다. 본 연구에서는 복막 내 중피세포 및 혈관벽에서 AQP-1발현은 고농도 포도당이 함유된 투석액으로 투석한 군에서 증가되어 Lai 등¹⁸⁾의 보고와 유사하였고, 이는 고농도의 포도당이 수분통로 발현에 관여함을 알 수 있었다.

 

복막투석액의 sodium의 농도는 혈액의 농도와 유사하나 고농도의 포도당으로 인한 한외여과는 투석초기에 가장 효과적이며, 수분통로를 통한 수분의 이동으로 인하여 투석액의 sodium 농도가 감소된다. Pannekeet 등²⁸⁾은 인체에서 3.86% 포도당 용액을 60분간 저류시켰을 때 감소된 sodium 농도를 수분통로의 기능을 나타내는 간접적인 증거로 제시하였다. 또한 Krediet 등²⁹⁾은 장기 복막투석 환자에서 한외여과 장애가 발생하고, 이들 환자의 투석 후 1시간에 투석액 내 sodium농도가 한외여과 장애가 없는 환자에 비해 현저히 높았으며, 이는 장기 복막투석에 의한 수분통로 발현감소에 따른 수분 이동 감소의 결과로 보고 하였다.

 

이와 반면 11년간 장기간 복막투석을 시행한 한외여과부전 환자의 사체검안에서 복막 내 수분통로의 발현이 복막투석을 새로 시작한 환자와 비교하여 차이가 없음이 보고²⁰⁾ 되었고, 이는 장기 복막투석 환자에서 수분통로 단백질의 변형 및 그에 따른 이차적인 기능장애가 관여할 가능성을 시사하였다. 본 연구에서는 투석액 대 혈장 sodium 농도가 투석군에서 대조군에 비해 유의한 감소를 보였으며, 이는 수분통로 발현의 증가와 더불어 수분통로를 통한 복강 내로의 수분이동이 증가됨을 알 수 있었다. 그러나 본 연구를 통하여 발현이 증가된 수분통로에 대한 단백질의 변형여부를 조사할 수 없었으며, 3개월의 단기간 동물실험이라는 제한점으로 인해 향후 보다 장기간의 실험이 필요할 것으로 생각된다.

 

후기당화산물은 단백질이 포도당 용액에 노출되면 포도당과 그 분해산물인 반응성 carboxyl 화합물이 단백질과 비효소적 반응으로 생기는 최종산물이다³⁰⁾. 이는 노화 현상이나 당뇨병의 만성 합병증과도 연관^31-33)이 있으며 복막투석 치료를 받고 있는 만성 신부전 환자의 복막에도 후기당화산물이 침착된다.

 

최근 연구보고에 의하면 후기당화산물은 투석액 내 당의 농도에 비례하여 복막에 축적되며³⁴⁾, 이는 기저막을 이루고 있는 콜라겐 등의 변형과 함께 복막의 확산저항을 감소시켜 복막투과도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 수분통로 역시 단백질로서 장기간 포도당에 노출될 경우 이상 중합반응이 예상된다. 실제로 수분통로 발현의 차이가 없음에도 한외여과부전이 있는 환자에서 수분통로 단백질의 당화작용으로 그 기능이 저하되었을 것으로 예상하고 있다.

 

본 연구에서는 수분통로 발현이 증가된 투석군에서 후기당화산물 발현도 높게 나타났다. 당화반응은 포도당이 단백질과 결합하여 수 시간 내지 수 일 내에 시작되며 여러 단계의 반응을 거쳐 4주가 지나면 비가역적인 후기당화산물이 생성되게 된다. 본 연구에서는 수분통로의 당화작용과 관계없이 수분통로를 통한 수분의 이동은 증가되어 수분통로의 기능이 비교적 잘 보존되어 있는 것으로 판단된다. 비록 3개월의 단기간 실험일지라도 수분통로에 대한 당화반응은 충분히 일어났을 것으로 보이나, 어느 정도의 후기당화산물의 축적이 기능이상을 초래하는지에 대한 것은 알 수가 없었다.

 

복막투과도와 관련되어 나타나는 한외여과부전은 장기 복막투석 환자에서 가장 중요한 문제이다. 투석기간이 장기화되면 점진적으로 복막의 기능은 악화되며^35-37), 원인으로 복막의 형태학적 변화는 당뇨병증과 유사한 여러 가지 혈관변화, 중피세포 탈락, 중피하 세포간질에 콜라겐 침착, 섬유화 및 경화 등이 있고, 기능적인 변화는 소분자물질인 포도당의 복막투과도 증가와 관련되어 발생한다.

 

Krediet 등³⁸⁾은 장기 복막투석 환자에서 고농도 포도당에 의한 신생혈관 생성의 증가가 한외여과부전의 중요한 원인 중 하나라고 보고하였고, Combet 등³⁹⁾은 급성 복막염 동물 모델에서 AQP-1 발현의 변화는 없었으나 혈관 투과도의 증가와 이로 인한 한외여과 장애를 관찰하였는데, 이는 Nitric Oxide의 분비 증가가 혈관벽의 투과도를 증가시키기 때문이라고 보고하였다. 또한 제 4형 콜라겐의 과도한 침착을 동반한 세포외기질의 팽창, 후기당화산물의 침착 등도 복막의 과투과도에 영향을 미치게 된다⁴⁰⁾.

 

본 연구에서도 복막 내 후기당화산물 발현이 증가된 투석군에서 대조군에 비해 과투과도 현상을 보였다. 하지만 후기당화산물 축적 외에 중피세포 탈락, 중피하 조직의 두께 증가, 신생혈관의 증가 등도 과투과도에 크게 기여했을 것으로 생각된다.

 

체중은 여러 환경요인에 의해 영향을 받기 때문에 실험동물의 전반적인 상태를 나타내는 중요한 지표로 알려져 있다, 본 연구에서 실험동물의 체중은 시간이 경과함에 따라 유의하게 증가하였으며 이는 적합한 환경에서 사육이 되었음을 반영한다. 하지만 투석군의 체중이 대조군에 비해 감소됨이 관찰되었는데, 이는 복막투석 과정 중의 조작, 감염방지를 위한 예방목적의 항생제 투여 및 투석자체가 스트레스로 작용하여 체중에 영향을 주었을 것으로 생각된다.

 

이상의 결과를 요약하면 복막투석 동물모델에서 장기간 고농도 포도당 투석액에 노출된 경우 복막 내 중피세포 및 혈관벽에서 AQP-1의 발현은 증가되었으며, 이는 복막의 수분 투과도를 증가시켜 복강 내로의 수분이동을 촉진하였다. 따라서 수분통로의 발현은 복막을 통한 한외여과에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다. 그러나 수분통로 발현의 증가가 고농도 포도당 투석액 자체의 영향인지 또는 만성 복막투석에 동반될 수 있는 한외여과장애에 대한 보상과정에 의한 것인지는 추후 연구가 필요하겠다.